تولید اسید استیک با استفاده از تخمیر هوازی

مقدمه

اسید استیک (CH₃COOH) یک اسید آلی ضعیف است که به عنوان جزء اصلی سرکه شناخته می شود و مسئول طعم ترش و بوی تند سرکه است. این ماده یک ماده شیمیایی مهم است که در نگهداری غذا، طعم دهی و بسیاری کاربردهای صنعتی استفاده می شود. اسید استیک را می ‌توان در مقیاس وسیع از طریق سنتز پتروشیمی یا از راه تخمیر تولید کرد. این مقاله یک مرور جامع بر تولید اسید استیک با تخمیر هوازی، فرآیند زیستی پشت تولید سرکه ارائه می‌ دهد. اگرچه بخش اعظم اسید استیک در جهان به صورت سنتتیک (صنعتی) تولید می ‌شود، مسیر تخمیری برای تولید سرکه خوراکی همچنان حیاتی است؛ زیرا بسیاری از استانداردها و قوانین غذایی ایجاب می‌ کنند که سرکه مورد استفاده منشأ زیستی (طبیعی) داشته باشد. در ادامه به جنبه ‌های کلیدی تخمیر هوازی اسید استیک می ‌پردازیم؛ از میکروب ‌ها و مسیرهای بیوشیمیایی دخیل گرفته تا روش ‌های تولید سنتی و مدرن، شرایط فرایندی و چشم ‌اندازهای آینده.

آشنایی با اسید استیک

اسید استیک که به نام اتانوئیک اسید نیز شناخته می شود، ساده ‌ترین اسید کربوکسیلیک پس از اسید فرمیک است. در شکل خالص، این ماده مایعی شفاف، بی رنگ و با بوی تند است. با رقیق شدن در آب تا غلظت حدود ۴ تا ۸ درصد، تبدیل به سرکه می‌ شود؛ ماده ‌ای که به عنوان یک چاشنی و نگهدارنده در سراسر جهان کاربرد گسترده ‌ای دارد. از نظر شیمیایی اسید استیک یک اسید ضعیف است که در محلول تنها به طور ناقص یونیزه می ‌شود. فرمول مولکولی آن C₂H₄O₂ که اغلب به صورت CH₃COOH نوشته می ‌شود است. در صنعت اسید استیک به عنوان ماده اولیه برای بسیاری از مواد شیمیایی (مانند وینیل استات و انیدرید استیک) و نیز به عنوان حلال استفاده می‌ شود. بسیاری از صنایع و خریداران به دنبال منابع مطمئن برای تأمین این ماده هستند و عبارتی مانند خرید اسید استیک فناوران گالن 30 لیتری دقیقاً به همین نیاز پاسخ می ‌دهد. در تخمیر هوازی از میکروارگانیسم ‌ها برای اکسید کردن اتانول به اسید استیک استفاده می ‌شود. این فرآیند طبیعی قرن ‌ها توسط انسان برای تهیه سرکه از خوراک ‌های الکلی مانند شراب، سیدر و ماءالشعیر تخمیری به کار گرفته شده است. تخمیر اسید استیک نه تنها سرکه ‌ای با طعم ترش ایجاد می‌ کند بلکه ترکیبات طعمی ماده اولیه را نیز حفظ می‌ کند، که باعث می ‌شود سرکه حاصل از تخمیر با اسید استیک سنتزی از لحاظ طعم و عطر متمایز باشد.

تخمیر هوازی برای تولید اسید استیک

اصطلاح تخمیر معمولاً به متابولیسم بی هوازی اشاره دارد، اما تخمیر اسید استیک یک مورد غیر معمول است این فرآیند تخمیر اکسایشی است که برای انجام حتماً به اکسیژن نیاز دارد. در این فرآیند زیستی دو مرحله‌ ای، ابتدا مخمرها به صورت بی هوازی قندها را به اتانول تخمیر می‌ کنند و سپس باکتری‌ های اسید استیک در حضور اکسیژن اتانول را به اسید استیک اکسید می ‌کنند. واکنش کلی این تبدیل را می ‌توان به سادگی خلاصه کرد: اتانول + اکسیژن → اسید استیک + آب. فرایند تخمیر به یک جریان مداوم هوا نیاز دارند، زیرا باکتری ها از اکسیژن به عنوان یک واکنش دهنده برای تبدیل الکل به اسید استفاده می کنند. اگر اکسیژن محدود باشد، این تبدیل متوقف خواهد شد یا محصولات جانبی ناخواسته تولید خواهند شد. از نظر تاریخی مردم پی بردند که اگر شراب در معرض هوا قرار گیرد با گذشت زمان به سرکه تبدیل می ‌شود؛ پدیده ای که به ترش شدن شراب معروف است. لویی پاستور در سال ۱۸۶۲ مشخص کرد که این دگرگونی توسط میکروارگانیسم ‌های زنده انجام می ‌شود و نه یک واکنش کاملاً شیمیایی صرف. تولید اسید استیک با تخمیر هوازی در اصل همان چیزی است که در ساخت سرکه رخ می ‌دهد، با این تفاوت که شرایط به صورت کنترل شده اعمال می‌ شود تا بازده اسید را به حداکثر برسانند و همزمان از فساد یا اکسیداسیون بیش از حد محصول جلوگیری شود.

میکروارگانیسم ‌های دخیل در تخمیر اسید استیک

باکتری‌ های تخصص یافته وظیفه اکسید کردن اتانول به اسید استیک را بر عهده دارند. باکتری های اسید استیک یک گروه از میکروب های گرم منفی میله ای شکل است که در خانواده استوباکتریاسه طبقه بندی می شود. این باکتری ‌ها هوازی اجباری هستند، به این معنی که برای رشد حتماً باید اکسیژن داشته باشند. سرده ‌های رایج درگیر شامل Acetobacter استوباکتر، Gluconobacter گلوکونوباکتر، Gluconacetobacter گلوکوناستوباکتر که در برخی منابع Komagataeibacter نامیده شده است و سایرین هستند. Acetobacter aceti و Acetobacter pasteurianus نمونه‌ های کلاسیکی هستند که به طور مکرر در تولید سرکه استفاده می ‌شوند. باکتری های اسید استیک به طور طبیعی در محیط‌ هایی که الکل وجود دارد یافت می شود برای مثال روی سطوح میوه ‌ها، در شهد گل‌ ها یا در آبجو و شراب غیر پاستوریزه. آن ها تمایل دارند به دلیل نیازشان به اکسیژن در سطح تماس هوا-مایع، لایه ‌ای روی سطح مایع تشکیل دهند (که اغلب مادر سرکه نامیده می ‌شود). این ریزجانداران به طرز قابل توجهی مقاوم به اسید هستند؛ در شرایط اسیدی که بسیاری از موجودات دیگر را متوقف می ‌کند می ‌توانند زنده بمانند و عمل کنند. هنگامی که آن‌ ها اتانول را به اسید استیک اکسید می‌ کنند، اسید تجمع یافته محیط خود مهارگری ایجاد می ‌کند، اما این باکتری‌ ها با سازگاری ‌هایی (مانند پمپاژ پروتون ‌های اضافی به بیرون و تغییر ترکیب غشای سلولی خود) می‌ توانند pH پایین را تحمل کنند. در مجموع بدون این باکتری‌ های هوازی سرسخت، تولید زیستی سرکه امکان پذیر نبود.

مسیر بیوشیمیایی اکسیداسیون اتانول

باکتری‌ های اسید استیک اتانول را از طریق یک مسیر آنزیمی دو مرحله ‌ای به اسید استیک تبدیل می‌ کنند. ابتدا اتانول با برداشت هیدروژن به استالدهید تبدیل می ‌شود و سپس استالدهید بیشتر به اسید استیک اکسید می ‌شود. این واکنش ‌ها توسط آنزیم‌ های متصل به غشا - الکل دهیدروژناز (ADH) و آلدهید دهیدروژناز (ALDH) - که در پری پلاسم سلول باکتری قرار دارند کاتالیز می ‌شوند. از آنجا که این آنزیم ‌ها در بیرون سیتوپلاسم قرار گرفته ‌اند، حدواسط‌های سمی (استالدهید) و محصولات (اسید استیک) داخل سلول انباشته نمی ‌شوند و این به محافظت از باکتری کمک می ‌کند. الکترون‌ های برداشته شده از اتانول از طریق یک کوفاکتور اغلب PQQ – پیرولوکینولین کینون در برخی گونه‌ ها به زنجیره تنفسی منتقل می ‌شوند، که در آنجا در نهایت اکسیژن را به آب کاهش می ‌دهند. این بدان معناست که این فرایند با فسفریلاسیون اکسیداتیو همراه است و به باکتری اجازه می‌ دهد از این اکسیداسیون انرژی (ATP) تولید کند. واکنش کلی را می ‌توان به صورت زیر نوشت: C₂H₅OH + O₂ → CH₃COOH + H₂O . نکته مهم این است که برخی گونه ‌های استوباکتر می ‌توانند در صورت تمام شدن اتانول و وفور اکسیژن، اسید استیک را بیشتر به دی اکسید کربن و آب متابولیزه کنند اساساً از طریق چرخه کربس محصول را بیش اکسید کنند. تولیدکنندگان سرکه تلاش می ‌کنند از این امر جلوگیری کنند، زیرا باعث کاهش بازده می ‌شود. با حفظ سطح کافی اتانول و خارج کردن سرکه در زمان مناسب، باکتری ‌ها در فاز اکسیداسیون ناقص نگه داشته می ‌شوند که در آن اسید استیک محصول نهایی است.

تخمیر سنتی سرکه (روش اورلئان)

تخمیر سنتی سرکه سالیان درازی است که با استفاده از روش کند اورلئان انجام می‌ شود که نام آن از شهر اورلئان فرانسه گرفته شده است، جایی که این روش رایج شد. در این رویکرد کلاسیک، شراب یا دیگر مایع الکلی را در بشکه ‌های چوبی می ‌ریزند که تا حدی پر شده و در معرض هوا قرار داده می ‌شوند. یک کشت آغازگر یا مقداری سرکه موجود (حاوی باکتری استوباکتر) برای تلقیح بشکه استفاده می ‌شود. باکتری ‌ها در حین تبدیل اتانول به اسید استیک طی چند هفته تا چند ماه، یک لایه ژلاتینی به نام مادر سرکه روی سطح مایع تشکیل می ‌دهند. بشکه ‌ها دارای سوراخ‌ ها یا دریچه‌ هایی برای اطمینان از جریان هوا هستند، اما این منافذ با توری ریز یا پارچه پوشانده می‌ شوند تا حشرات وارد نشوند ولی اکسیژن بتواند وارد شود. این روش از سده ۱۷ میلادی استفاده شده اند و معمولاً یک تا سه ماه طول می کشد تا یک نوبت سرکه به طور کامل تخمیر شود. نتیجه اغلب سرکه ‌ای با کیفیت و طعم عالی است زیرا تخمیر آهسته و کهنگی در بشکه چوبی اجازه می ‌دهد ترکیبات طعم دهنده پیچیده ‌ای توسعه یابند. پس از آماده شدن، بخشی از سرکه برداشت می ‌شود و بشکه با خوراک الکلی تازه پر می ‌شود که امکان ادامه فرآیند به شکل مداوم یا نوبتی را فراهم می‌ کند. با این حال روش اورلئان پرزحمت و کند است و حجم نسبتاً کمی سرکه (اغلب حدود ۴ تا ۸٪ اسید استیک) را در یک مدت طولانی تولید می‌ کند. تا حد زیادی این روش توسط روش ‌های سریع ‌تر برای تولید تجاری جایگزین شده است، اما همچنان توسط برخی سازندگان سنتی سرکه که به عطر و طعم برتر سرکه تولید شده اهمیت می ‌دهند استفاده می ‌شود.

روش سریع تولید سرکه (روش مولد)

در قرن نوزدهم تقاضا برای سرکه از روش تخمیر آهسته در بشکه پیشی گرفت و به توسعه فرایند سریع یا روش مولد منجر شد. این روش توسط سازنده سرکه آلمانی، شولتنباخ در دهه ۱۸۲۰–۱۸۳۰ ابداع شد و ایده فراهم کردن سطح تماس بزرگ ‌تر و هوادهی بهتر برای تسریع اسیدی شدن را معرفی کرد. در یک دستگاه مولد معمولی، یک مخزن چوبی بلند با یک ماده پرکننده بی اثر و غیر متراکم مانند تراشه‌ های چوب راش یا زغال پر می‌ شود. مایع الکلی (برای مثال شراب یا آبجوی مالت) از بالا روی این ماده پرکننده به صورت چکه ‌ای یا اسپری پخش می ‌شود، در حالی که هوای تازه از پایین به داخل کشیده شده یا دمیده می ‌شود. باکتری‌ های اسید استیک بر سطح مواد پرکننده ساکن هستند (اغلب بیوفیلم تشکیل می ‌دهند)، بنابراین وقتی مایع به پایین نفوذ کرده و تراشه‌ ها را پوشش می ‌دهد، باکتری ‌ها به سرعت اتانول را به اسید استیک اکسید می ‌کنند. این طراحی تماس بین مایع، باکتری و اکسیژن را به طور چشمگیری افزایش می‌ دهد. یک مولد می ‌تواند یک نوبت سرکه را تنها در ۱ تا ۲ هفته تولید کند که بسیار سریع ‌تر از روش بشکه ‌ای اورلئان است. معمولاً سرکه پس از یک چرخه برداشت می ‌شود (اغلب هنگامی که به حدود ۶–۱۰٪ اسیدیته می‌ رسد) و بستر الکلی جدید اضافه می‌ شود تا فرآیند ادامه یابد. روش مولد یک نقطه عطف در تولید صنعتی سرکه بود که امکان خروجی بالاتر را فراهم کرد. هرچند این روش نیاز به پایش دقیق دما و جریان هوا داشت، تجمع بیش از حد گرما می ‌توانست باکتری ‌ها را بکشد یا الکل را تبخیر کند، در حالی که هوادهی ضعیف تخمیر را کند می‌کرد. بسیاری از واحدهای اولیه تولید تجاری سرکه این تکنیک مولد چکه ای را به کار گرفتند که تا اواسط قرن بیستم، پیش از ظهور سیستم ‌های تخمیر غوطه ‌ور سریع‌ تر به طور گسترده مورد استفاده بود.

فناوری تخمیر غوطه ور برای سرکه

در تولید صنعتی مدرن اسید استیک از طریق تخمیر، اغلب از سیستم‌ های تخمیر غوطه ور استفاده می ‌شود. در فرآیند غوطه ور، باکتری ‌ها به طور فعال در مایع معلق هستند و با روش ‌های مکانیکی هوادهی فراوان دریافت می‌ کنند (مثلاً با استفاده از هواده‌ ها و همزن ‌ها در یک مخزن استیل ضدزنگ موسوم به استاتور). برخلاف روش ‌های اورلئان و مولد که در آن ‌ها اکسیژن فقط در سطح یا فصل مشترک هوا-مایع به باکتری می ‌رسد، تخمیر غوطه ور هوا (یا اکسیژن) را به طور پیوسته در مایع حل می‌ کند و اطمینان می ‌دهد که تمام محیط کشت به خوبی هوا دهی شده است. این هوادهی شدید همراه با کنترل دما و هم زدن خودکار به باکتری ‌ها اجازه می‌ دهد با نرخ بهینه کار کنند. در نتیجه می ‌توان سرکه را با سرعت بسیار زیاد تولید کرد، غالباً در عرض ۲۴ تا ۴۸ ساعت در هر نوبت که غلظت‌ های اسید استیک به ۱۲–۱۵ درصد می ‌رسد. در این استاتورها حسگرها پارامترهایی مانند دما، pH و محتوای الکل را پایش می‌ کنند. سیستم‌ های خنک کننده گرمای اضافی تولید شده توسط اکسیداسیون شدید (زیرا این فرایند گرمازا است) را حذف می ‌کنند و محیط کشت را در حالت بهینه (معمولاً حدود ۳۰ درجه سانتی گراد) نگه می ‌دارند. بسیاری از سیستم‌ ها به صورت نیمه پیوسته عمل می ‌کنند: بخشی از سرکه تخمیر شده به طور دوره ‌ای تخلیه شده و با محلول الکل تازه جایگزین می ‌شود (این کار فرآیند را در حال اجرا نگه داشته و در عین حال محصول برداشت می ‌شود). تخمیر غوطه ور به یک کشت آغازگر خالص از باکتری ‌های اسید استیک قوی و شرایط استریل نیاز دارد تا از آلودگی جلوگیری شود، اما کارایی و بازده بی نظیری را ارائه می ‌دهد. امروزه تولیدکنندگان بزرگ، سرکه سفره، سرکه سفید تقطیری و انواع دیگر را در مقیاس صنعتی با استفاده از این تخمیرکننده ‌های هوازی خودکار تولید می ‌کنند و تقاضای جهانی را با هزینه تولید نسبتاً پایین تأمین می ‌کنند.

شرایط بهینه برای تخمیر اسید استیک

باکتری‌ های اسید استیک زمانی بهترین عملکرد را دارند که شرایط رشد معینی فراهم شود. دما، اسیدیته (pH)، تأمین اکسیژن و غلظت بستر همگی بر موفقیت فرایند تخمیر تأثیر می‌ گذارند. بیشتر تخمیرهای سرکه در دماهای گرم مزوفیلیک انجام می‌ شوند، معمولاً در محدوده ۲۵–۳۰ درجه سانتی گراد، زیرا آنزیم‌ های باکتری ‌ها در این دما به طور کارآمد عمل می ‌کنند. اگر دما خیلی خنک شود، فرایند به شدت کند می ‌شود؛ اگر خیلی داغ شود (بالای ~۳۵ درجه سانتی گراد)، باکتری ‌ها تحت تنش قرار گرفته یا از بین می‌ روند . pH محیط در شروع معمولاً به حدود ۵ تا ۶ تنظیم می ‌شود. در حالی که باکتری ‌های اسید استیک می ‌توانند pH پایین را تحمل کنند، آن ‌ها محیط کمی اسیدی ولی نه بیش از حد ترش را برای رشد بهینه ترجیح می‌ دهند. برخی تولیدکنندگان محموله را با کمی سرکه برای شروع اسیدی می ‌کنند حدود pH 4–5 که به جلوگیری از رشد میکروب‌ های ناخواسته کمک می ‌کند، اما هنوز برای سرکه ‌سازها قابل تحمل است. اکسیژن یکی از مهم ‌ترین عامل است، این باکتری ‌ها هوازی اجباری هستند، بنابراین هوادهی مداوم در یک تخمیرکننده بسته یا تماس سطحی کافی در یک محیط باز لازم است. از همه مهم ‌تر، اطمینان از انتقال کافی اکسیژن است؛ اکسیژن کم منجر به اکسیداسیون ناقص اتانول شده و ممکن است باعث تجمع محصولات جانبی مانند استالدهید شود، در حالی که هوادهی مناسب از تبدیل کامل به اسید استیک پشتیبانی می ‌کند. غلظت اتانول و اسید استیک تجمع یافته نیز باید متعادل باشد. معمولاً اتانول اولیه ۶–۱۰٪ ایده‌ آل است: خیلی کم باشد اسید زیادی تولید نمی ‌شود؛ خیلی زیاد باشد فعالیت باکتری ‌ها متوقف می‌ شود. با تجمع اسید استیک، pH را کاهش داده و به میکروب ‌ها فشار وارد می‌ کند، اغلب سویه ‌ها فراتر از حدود ۱۲–۱۵٪ محتوای اسید استیک کارکرد خوبی ندارند. حذف دوره ‌ای سرکه (یا رقیق سازی در فرآیندهای پیوسته) می‌ تواند مهار محصول را کاهش دهد. جدول زیر پارامترهای کلیدی و محدوده ‌ها/اثرات بهینه آن ‌ها را در تخمیر هوازی اسید استیک خلاصه می‌ کند:

بازده و کارایی در تخمیر اسید استیک

در تولید اسید استیک به روش تخمیر هوازی، بازده و کارایی ملاحظات کلیدی هستند. بازده نظری تبدیل اتانول به اسید استیک بسیار بالا است در واقع، اگر اتانول به طور کامل به اسید استیک اکسید شود و نه بیشتر به CO₂، تقریباً تمام اتانول می ‌تواند به اسید استیک تبدیل شود. در عمل بازده‌ های ۹۰٪ یا بیشتر (از حداکثر نظری) در تخمیرهای با مدیریت خوب قابل دستیابی هستند. مقداری از اتانول ممکن است به دلیل تبخیر (به ویژه در فرایندهای باز) یا به این علت که کسری کوچک ممکن است به طور کامل به دی اکسید کربن و آب اکسید شود، از دست برود. کارایی ارتباط نزدیکی با میزان تأمین اکسیژن و نحوه مدیریت حرارت دارد. یک فرایند بسیار کارا اتانول را به سرعت به اسید استیک تبدیل می‌ کند (نرخ تولید بالا) و محصولات جانبی کمی تولید می ‌کند. برای مثال استاتورهای مدرن می ‌توانند نرخ‌ های تولیدی به مراتب بالاتر از روش ‌های سنتی داشته باشند شاید چندین گرم اسید استیک در لیتر بر ساعت تولید کنند، در مقابل کسری کوچک از آن در تخمیرهای سطحی آهسته. جنبه دیگر کارایی، انرژی و نیروی کار است: روش ‌های سریع و غوطه ‌ور کاراتر در نظر گرفته می ‌شوند زیرا زمان تخمیر را از ماه‌ ها به روزها کاهش می‌ دهند و هوادهی را خودکار می‌ کنند، بنابراین نیروی کار و فضای کمتری به ازای هر حجم تولیدی نیاز است. با این حال تخمیر سریع باید به دقت کنترل شود؛ اگر به باکتری ‌ها فشار بیش از حد وارد شود (مثلاً تغذیه اتانول بیش از حد سریع یا هوادهی بیش از اندازه) ممکن است گرمای اضافی تولید کنند یا از اسید استیک فراتر رفته و به بیش اکسایش دچار شوند که کارایی بازده را کاهش می ‌دهد. معمولاً در محیط‌ های صنعتی، با استفاده از سویه ‌های باکتریایی عملکرد بالا، حفظ شرایط بهینه تخمیر و گاهی با بازیافت سلول ‌ها (استفاده از باکتری ‌های ثابت شده یا نگه داشتن بیومس در راکتور)، کارایی به حداکثر می ‌رسد. بازده با تیتر کردن اسید استیک تولید شده و مقایسه آن با اتانول اولیه موجود اندازه‌ گیری می ‌شود؛ در سیستم‌ های پیوسته بازده با اندازه‌ گیری اتانول باقی مانده پایش می ‌شود تا اطمینان حاصل شود تقریباً تبدیل کامل انجام شده است.