بهینه سازی سویه های میکروبی برای افزایش بازده تولید اسید استیک

مقدمه

اسید استیک یک ماده شیمیایی پرکاربرد است که به عنوان ماده نگهدارنده غذایی (سرکه) استفاده می شود و در تولید پلیمرها، حلال ها و داروها نیز یک ماده صنعتی مهم به شمار می رود. با اینکه بیشتر اسید استیک در حال حاضر از روش های پتروشیمیایی تولید می شود، علاقه به فرایندهای تخمیر میکروبی پایدار در حال افزایش است. سویه های میکروبی مانند باکتری های تولید کننده اسید استیک قادرند خوراک های تجدید پذیر را به اسید استیک تبدیل کنند، اما بازده تولید در فرایندهای تخمیر همچنان کمتر از میزان مطلوب برای تولید در مقیاس بالا باقی مانده اند. بهینه سازی سویه های میکروبی برای دستیابی به بازده بالاتر تولید اسید استیک به امری حیاتی تبدیل شده است تا کارایی و صرفه اقتصادی تولید زیستی افزایش یابد. این کار مستلزم بهبود مسیرهای متابولیکی میکروب ها، افزایش تحمل آن ها به شرایط اسیدی و ارتقای بهره وری کلی از طریق فنون پیشرفته در توسعه سویه ها است. در بخش های بعدی راهبردهای کلیدی برای بهینه سازی سویه های میکروبی به منظور افزایش بازده تولید اسید استیک مورد بررسی قرار می گیرند.

اهمیت اسید استیک و بهینه سازی بازده تولید

اسید استیک هم به عنوان یک ماده نگهدارنده ارزشمند در صنایع غذایی عمل می کند و هم یک ماده شیمیایی پایه در صنعت است که تولید کارآمد آن بسیار حائز اهمیت است. در صنایعی از فرایند مواد غذایی گرفته تا ساخت پلاستیک، تقاضا برای اسید استیک پیوسته در حال افزایش است. برای اینکه تولید زیستی این ماده مقرون به صرفه و پایدار باشد، دستیابی به بازده بالای تخمیر اسید استیک ضروری است. هر بهبودی در بازده به معنای تولید محصول بیشتر از همان مقدار ماده اولیه است که منجر به کاهش اتلاف و هزینه ها می شود. بازده های بالای اسید استیک تضمین می کند که فرایندهای تخمیر میکروبی از نظر کارایی قادر به رقابت با روش های پتروشیمیایی سنتی باشند. در گذشته، تخمیر سنتی سرکه فقط به غلظت های متوسطی از اسید استیک دست می یافت، اما فرایندهای مدرن دستیابی به غلظت های بسیار بالاتر را هدف گرفته اند. در همین راستا در بخش بازرگانی نیز نیاز به خرید اسید استیک صادراتی بشکه ‌ای برای تأمین صنایع داخلی و صادراتی رو به افزایش است. حداکثر کردن تبدیل ماده اولیه به محصول، محصولات جانبی ناخواسته را نیز به حداقل می‌رساند و تصفیه نهایی را ساده‌ تر می‌ کند. بنابراین بهینه‌ سازی عملکرد سویه در اصل به معنای رسیدن به بیشترین بازده ممکن اسید استیک درون بیوراکتور، بدون به خطر انداختن پایداری یا دوام فرایند است.

مسیرهای میکروبی برای تولید اسید استیک

میکروارگانیسم ها برای تولید اسید استیک از دو مسیر اصلی استفاده می کنند: مسیر اکسیداسیون هوازی و مسیر تخمیر بی هوازی. در روش هوازی، باکتری های اسید استیک مانند Acetobacter و Gluconobacter اتانول را در حضور اکسیژن به اسید استیک اکسید می کنند. این فرآیند پایه تولید سرکه است و معمولا نیازمند یک مرحله اولیه تخمیر الکلی توسط مخمر برای تولید اتانول می باشد. در مقابل، تولید اسید استیک در شرایط بی هوازی توسط باکتری‌ های استوژن مانند گونه‌ های Clostridium یا Acetobacterium انجام می‌ گیرد که قندها یا حتی گازهایی مانند CO₂ و H₂ را بدون نیاز به اکسیژن مستقیماً به اسید استیک تخمیر می‌ کنند. هر کدام از این دو مسیر مزایا و محدودیت های خاصی دارند. مسیر هوازی سریع تر است اما به تامین اتانول و اکسیژن وابسته است، در حالی که مسیر بی هوازی انعطاف بیشتری در استفاده از منابع متنوع دارد ولی سرعت تولید آن کمتر است. بهینه سازی سویه ها در هر مسیر برای افزایش بازده اهمیت بالایی دارد. در شرایط ایده آل، باکتری های اسید استیک می توانند تقریبا کل اتانول را به اسید استیک تبدیل کنند و باکتری های استوژن نیز قادرند بخش اعظم کربن قند یا گاز را با کمترین تولید توده زیستی به اسید استیک تغییر دهند.

میکروارگانیسم های کلیدی در تخمیر اسید استیک

چندین نوع میکروارگانیسم به خاطر توانایی شان در تولید اسید استیک شناخته شده اند و هر کدام ویژگی های منحصر به فرد خود را دارند. باکتری های اسید استیک جزو برجسته ترین این ارگانیسم ها هستند که از جمله آن ها می توان به گونه هایی مانند Acetobacter aceti، Acetobacter pasteurianus و Komagataeibacter europaeus اشاره کرد. این باکتری ها در شرایط هوازی به خوبی رشد می کنند و به طور سنتی در تخمیر سرکه به کار می روند، زیرا می توانند غلظت های متوسط تا بالای اسید استیک را تحمل کنند (برخی سویه ها تا حدود ۱۰٪ اسید را تاب می آورند). این باکتری ها اتانول را به شکل کارآمدی به اسید استیک اکسید می کنند. در مقابل، باکتری های استوژن بی هوازی مانند Clostridium aceticum، Moorella thermoacetica و Acetobacterium woodii می توانند قندها یا گازها را تخمیر کرده و اسید استیک تولید کنند. این بی هوازی ها از مسیر استیل کوآ (چرخه وود لیونگدال) بهره می گیرند و اسید استیک را به طور مستقیم به عنوان محصول اصلی تولید می کنند. علاوه بر این برخی سویه های دست ورزی شده میکروبی از جمله سویه های آزمایشگاهی Escherichia coli نیز برای تولید بیش از حد اسید استیک توسعه یافته اند، با اینکه به طور طبیعی تولید کننده این اسید نیستند. این باکتری ها با نرخ ها و میزان تحمل گوناگون اسید استیک تولید می کنند و شناسایی سویه مناسب نخستین گام به سوی بهینه سازی بازده تولید است. قابلیت ها و محدودیت های خاص هر ارگانیسم، راهبردهای مورد استفاده برای بهبود سویه را تعیین می کند.

چالش های تولید زیستی اسید استیک

تولید اسید استیک از طریق تخمیر با چالش های اساسی روبه رو است که مهم ترین آن بازدارندگی محصول می باشد. در این حالت خود اسید استیک تجمع یافته در محیط به عنوان عامل محدودکننده عمل کرده و شرایط رشد میکروب ها را دشوار می سازد. کاهش pH محیط سبب می شود اسید استیک به شکل تفکیک نشده از غشای سلول عبور کند و پس از ورود، درون سلول تفکیک شود. این پدیده موجب اسیدی شدن داخلی، مهار آنزیم ها و ایجاد تنش متابولیکی می شود و اغلب منجر به کند شدن رشد یا توقف زودهنگام تخمیر پیش از مصرف کامل مواد اولیه خواهد شد. در فرایندهای هوازی حضور همزمان غلظت بالای اتانول و افزایش اسید استیک همراه با گرمای تولید شده، فشار مضاعفی بر باکتری ها وارد می کند. در حالت بی هوازی نیز اسیدی شدن شدید محیط ایجاب می کند pH پیوسته خنثی گردد که منجر به تشکیل نمک های استات و دشواری در بازیابی محصول نهایی می شود. علاوه بر این بسیاری از سویه های پربازده رشد کندی داشته یا نسبت به ناخالصی ها حساس هستند که محدودیت بیشتری ایجاد می کند.

روش های کلاسیک بهبود سویه

دانشمندان به طور تاریخی از چندین روش کلاسیک برای بهبود سویه های میکروبی در تولید اسید استیک استفاده کرده اند. یکی از قدیمی ترین رویکردها جهش زایی تصادفی است؛ در این روش میکروارگانیسم ها در معرض عوامل موتاژن مانند پرتوتابی UV یا مواد شیمیایی قرار می گیرند و سپس غربالگری انجام می شود تا جهش یافته های نادری که بازده اسید استیک بالاتر یا تحمل بیشتری دارند شناسایی شوند. برای مثال از موتاژنز در باکتری های اسید استیک استفاده شده تا واریانت هایی به دست آیند که شرایط اسیدی شدیدتری را تحمل می کنند یا اسید بیشتری تولید می کنند. راهبرد سنتی دیگر انتخاب و اهلی کردن جدایه های طبیعی است. کشت های تخمیری (مانند مادر سرکه) اغلب طی سالیان نگهداری می شدند که در طی آن به تدریج بهترین باکتری های سازگار باقی می ماندند. با جداسازی سویه ها از منابعی مانند میوه ها، تخمیرهای سرکه یا خاک، پژوهشگران توانستند تولید کنندگان اسید استیک مستحکم طبیعی را بیابند. تکنیک هایی مانند نوترکیبی ژنومی که شامل ترکیب DNA از چندین سویه والد برای تجمع ویژگی های مطلوب است نیز برای تکامل سویه های برتر به کار گرفته شده اند. این روش های مرسوم پرزحمت و تا حدی مبتنی بر آزمون و خطا هستند، اما پایه و اساس بهینه سازی سویه را فراهم کردند زیرا سویه های بهبود یافته ای ارائه دادند و صفات مهم برای تولید بالاتر اسید استیک را آشکار ساختند.

راهبردهای مهندسی متابولیک برای افزایش بازده

مهندسی متابولیک یکی از مهم ترین ابزارهای نوین برای افزایش تولید اسید استیک در سویه های میکروبی به شمار می رود. در این رویکرد مسیرهای ژنتیکی و آنزیمی به طور مستقیم بازطراحی می شوند تا بخش بیشتری از جریان کربن به سمت تولید اسید استیک هدایت گردد و از تشکیل محصولات جانبی یا رشد اضافی توده زیستی جلوگیری شود. یکی از روش های رایج، افزایش بیان آنزیم های کلیدی مانند الکل دهیدروژناز (ADH) و آلدهید دهیدروژناز است که منجر به تسریع تبدیل اتانول به اسید استیک می شود. حذف مسیرهای رقیب نیز اهمیت دارد، زیرا مانع انحراف کربن به سمت ترکیباتی نظیر لاکتات یا بوتیرات می گردد و به این ترتیب تولید استات افزایش می یابد. بهبود تعادل انرژی و کوفاکتورهای سلولی مانند NAD⁺/NADH نیز تضمین می کند که واکنش ها به طور پایدار ادامه پیدا کنند. علاوه بر این، با وارد کردن ژن های جدید یا ترانسپورترهای ویژه می توان خروج اسید استیک از سلول را تسهیل کرد و بازدارندگی ناشی از تجمع محصول را کاهش داد. در نتیجه سویه های مهندسی شده عملکردی به مراتب بهتر از نوع وحشی خواهند داشت.

افزایش تحمل اسید استیک در سویه های باکتریایی

تحمل بالای میکروب ها نسبت به اسید استیک یک عامل کلیدی در دستیابی به بازده بیشتر تولید است، زیرا هر چه مقاومت بالاتر باشد امکان رسیدن به غلظت های بیشتری از محصول پیش از توقف تخمیر فراهم می شود. برای افزایش این تحمل، رویکردهای گوناگونی به کار گرفته شده است. یکی از آن ها مهندسی غشای سلولی است که با تغییر ترکیب لیپیدها یا ضخیم کردن پوشش غشا، ورود اسید به سلول را محدود می کند. بسیاری از باکتری های اسید استیک به طور طبیعی با افزودن اسیدهای چرب اشباع یا لیپیدهای حفاظتی خاص، نفوذ اسید را کاهش می دهند. راهبرد دیگر تقویت سامانه های فعال دفع اسید است، مانند پمپ های پروتون یا ترانسپورترهای نوع ABC که اسید و یون های اضافی را از سلول بیرون می رانند. همچنین افزایش بیان پروتئین های پاسخ به تنش مثل چپرون ها و آنزیم های ترمیم DNA، مقاومت سلول را تقویت می کند. نمونه روشن آن سویه ای از Acetobacter است که با پر بیان ژن UvrA توانست در ۶٪ اسید استیک عملکرد بهتری داشته باشد. علاوه بر این، تقویت مسیرهای متابولیکی خنثی سازی اسید و تولید ترکیبات حفاظتی مانند گلوتامات و ترهالوز به افزایش مقاومت کمک می کند.

بهینه سازی اکسیداسیون اتانول در باکتری های اسید استیک

در باکتری های سرکه ساز، بهینه سازی مسیر اکسیداسیون اتانول نقشی حیاتی در افزایش بازده و سرعت تولید اسید استیک دارد. تمرکز اصلی در این زمینه بر آنزیم الکل دهیدروژناز (ADH) وابسته به PQQ و آنزیم آلدهید دهیدروژناز است. با پر بیان این آنزیم ها، سویه های مهندسی شده توانسته اند اتانول را با کارایی بسیار بیشتری به اسید استیک تبدیل کنند. نمونه بارز آن سویه اصلاح شده Acetobacter pasteurianus است که توانایی اکسیداسیون سریع اتانول حتی در غلظت های بالا را نشان داد، جایی که سویه های وحشی دچار بازدارندگی می شوند. علاوه بر این، تقویت مکانیسم های تحمل اتانول مانند مستحکم تر کردن غشا یا افزایش پروتئین های حفاظتی سبب شده است این سویه ها تخمیر را با سطوح بالاتری از اتانول آغاز کنند و در نهایت محصول بیشتری به دست آید. نکته مهم دیگر جلوگیری از اکسیداسیون بیش از حد اسید تولیدی است که با انتخاب سویه های مناسب یا مهندسی متابولیک برطرف می شود.

فرگشت آزمایشگاهی تطبیقی برای بهبود سویه

فرگشت آزمایشگاهی تطبیقی (ALE) روشی موثر برای بهبود سویه های میکروبی و افزایش بازده تولید اسید استیک است. در این روش، جمعیت میکروبی طی نسل های متوالی در شرایطی با تنش افزایشی مانند غلظت بالاتر اسید استیک یا کاهش pH کشت داده می شود تا سلول های مقاوم تر انتخاب شوند. این فرایند باعث ایجاد واریانت هایی می شود که می توانند در شرایطی رشد کنند که برای سویه اولیه بازدارنده بوده است. ALE توانایی ایجاد تغییرات همزمان در چندین ژن را دارد که مجموعا مقاومت و بهره وری را ارتقا می دهد، ویژگی ای که با مهندسی مستقیم به سختی قابل دستیابی است. نمونه بارز آن تکامل سویه Acetobacter است که پس از پاساژ سریالی توانست در غلظت های بالاتر اسید به خوبی رشد کند. علاوه بر این از ALE برای بهبود ویژگی هایی مانند تحمل به اتانول و مقاومت دمایی نیز استفاده شده است. در نهایت سویه های حاصل با تعیین توالی ژنومی مورد بررسی قرار می گیرند تا جهش های موثر شناسایی شوند.

رویکردهای اومیکس و زیست شناسی سامانه ای

فناوری های اومیکس مانند ژنومیک، ترنسکریپتومیک، پروتئومیک و متابولومیک دیدی جامع از عملکرد سویه های میکروبی ارائه می دهند و امکان بهینه سازی دقیق تر آن ها را فراهم می کنند. تعیین توالی ژنوم میکروب های تولید کننده اسید استیک به پژوهشگران کمک می کند تا ژن ها و مسیرهای کلیدی موثر در تولید یا مقاومت به تنش را شناسایی کنند. مقایسه ژنوم سویه های مقاوم و حساس معمولا تفاوت هایی مانند وجود ژن های اضافی یا جهش های تنظیمی را آشکار می سازد که می توان از آن ها در اصلاح سویه ها استفاده کرد. بررسی ترنسکریپتوم و پروتئوم نیز نشان می دهد که کدام ژن ها و پروتئین ها هنگام تولید یا در شرایط استرس تغییر بیان می دهند و گلوگاه های متابولیکی یا مکانیزم های حفاظتی کدامند. برای نمونه بیان زیاد یک پروتئین ترانسپورتر در سویه مقاوم نشان می دهد که تقویت همان ژن در سویه های دیگر می تواند بازده را افزایش دهد. داده های اومیکس در مدل های زیست شناسی سامانه ای ادغام می شوند و امکان شبیه سازی شرایط یا تغییرات ژنتیکی را فراهم می کنند. در نهایت، این رویکردها مسیر بهینه سازی سویه را از حالت آزمایش و خطا به یک طراحی علمی مبتنی بر داده تبدیل کرده اند.

زیست شناسی سنتتیک و ابزارهای ژنتیکی در بهینه سازی سویه

پیشرفت های اخیر در ابزارهای مهندسی ژنتیک باعث شده است که فرایند بهینه سازی سویه های میکروبی برای تولید اسید استیک با سرعت و دقت بیشتری انجام گیرد. فناوری های زیست شناسی سنتتیک مانند CRISPR/Cas9، CRISPRi و سامانه های نوترکیبی کارآمد، امکان تغییر یا تنظیم دقیق ژن های کلیدی را فراهم کرده اند. این ابزارها حتی در گونه هایی که قبلا دستکاری آن ها دشوار بود، مانند برخی Acetobacter و Komagataeibacter، موفقیت آمیز عمل کرده اند. برای مثال حذف ژن های دخیل در اکسیداسیون بیش از حد اسید استیک یا فعال سازی ژن های تقویت کننده تولید مانند تامین کننده کوفاکتور PQQ توانسته است بازده تولید را افزایش دهد. تفاوت اصلی این رویکردها با روش های قدیمی در هدفمند بودن آن ها است، به طوری که می توان یک ژن بازدارنده را حذف یا یک پروموتر مصنوعی را برای بیان بیشتر ژن های مقاومت وارد نمود. همچنین، استفاده از وکتورهای پایدار برای بیان چند ژن و پروموترهای فعال شونده در شرایط اسیدی امکان تولید سویه های مقاوم تر و کارآمدتر را فراهم کرده است. این نوآوری ها زیست شناسی سنتتیک را به ابزاری حیاتی برای ارتقای بهره وری و پایداری تولید اسید استیک تبدیل کرده اند.

رویکردهای کشت همزمان و همزیستی میکروبی

یکی از راهکارهای نوین برای افزایش تولید اسید استیک، استفاده از کشت همزمان یا همزیستی چند میکروارگانیسم است. در این روش به جای تکیه بر یک سویه منفرد، چند گونه مختلف به صورت مشترک در تخمیر شرکت می کنند و هر یک وظیفه ای مکمل دیگری را انجام می دهند. نمونه شناخته شده این روش در تولید سرکه است که مخمرها مانند Saccharomyces cerevisiae ابتدا قندها را به اتانول تخمیر می کنند و سپس باکتری های اسید استیک نظیر Acetobacter pasteurianus همان اتانول را به اسید استیک تبدیل می نمایند. این همکاری باعث کاهش زمان فرایند و افزایش بازده نهایی می شود زیرا اتانول به طور پیوسته و در سطح مطلوب در اختیار باکتری قرار می گیرد. علاوه بر این، کشت همزمان می تواند اثرات بازدارنده مانند تغییرات شدید محیطی را کاهش دهد و شرایط مناسب تری برای رشد فراهم کند. فراتر از سرکه، ترکیب میکروب های تجزیه کننده زیست توده با باکتری های تولید کننده استات نیز نشان داده است که می توان از مواد اولیه ارزان به طور مستقیم اسید استیک به دست آورد.

یکپارچه سازی بهینه سازی سویه و فرایند

برای دستیابی به بیشترین بازده تولید اسید استیک لازم است هم سویه میکروبی و هم شرایط فرایند تخمیر به صورت همزمان بهینه شوند. سویه بهبود یافته تنها در شرایط کشت مناسب می تواند پتانسیل واقعی خود را نشان دهد و در مقابل، حتی سویه های معمولی نیز در شرایط بهینه قادر به تولید بالاتر خواهند بود. عوامل کلیدی فرایند شامل راهبرد تغذیه سوبسترا، میزان هوادهی، کنترل دقیق pH و مدیریت دما هستند که باید مطابق ویژگی های سویه تنظیم شوند. برای نمونه، اگر سویه توان تحمل اتانول بیشتری داشته باشد، می توان از روش بچ تغذیه ای بهره گرفت و غلظت های بالاتری از اتانول را وارد محیط کرد تا اسید استیک بیشتری تولید شود. همچنین سویه های مقاوم به اسید امکان ادامه تخمیر تا pH پایین تر و اسیدیته نهایی بیشتر را فراهم می کنند. هوادهی کافی در فرایندهای هوازی برای اکسیداسیون اتانول حیاتی است و به همین دلیل طراحی بیوراکتور باید بر اساس تامین بهینه اکسیژن انجام گیرد. در شرایط بی هوازی، حذف پیوسته اسید یا خنثی سازی محیط به کاهش اثر بازدارنده کمک می کند، هرچند مراحل جداسازی محصول پیچیده تر خواهد شد. به کارگیری ابزارهای آماری مانند روش سطح پاسخ نیز می تواند ترکیب بهینه عوامل موثر را مشخص کند. چنین رویکردی موجب افزایش بهره وری و پایداری تولید صنعتی می شود.

پیشرفت های شاخص در بهبود سویه های تولید کننده اسید استیک

در سال‌ های اخیر بهینه ‌سازی سویه‌ های میکروبی برای تولید بیشتر اسید استیک با پیشرفت‌ های قابل ‌توجهی همراه بوده است. این بهبودها شامل استفاده از روش ‌های کلاسیک مانند جهش ‌زایی تصادفی و انتخاب طبیعی تا تکنیک‌ های مدرن مانند مهندسی متابولیک و فرگشت تطبیقی می ‌شود. برای نمونه، با ایجاد جهش در باکتری‌ های Acetobacter، سویه ‌هایی با تحمل بیشتر به اسید و بازده بالاتر تولید شده‌ اند. همچنین، بیش ‌بیان آنزیم‌ های کلیدی در مسیر اکسیداسیون اتانول موجب افزایش سرعت تولید اسید استیک شده است. پژوهشگران با به ‌کارگیری ژن‌ های مقاومتی مانند ژن‌ های ترمیم DNA، توانسته ‌اند پایداری سویه ‌ها را در محیط‌ های اسیدی ارتقا دهند. از سوی دیگر، استفاده از کشت ‌های همزمان (مخمر + باکتری) به بهبود بازده تخمیر کمک کرده است. جداسازی سویه‌ های جدید از طبیعت به ‌ویژه گونه‌ های گرمادوست، و حذف مسیرهای متابولیکی رقیب نیز به افزایش بازده نهایی تولید منجر شده‌ اند و مسیر را برای تولید صنعتی پایدارتر هموار کرده‌ اند. جدول زیر شماری از راهبردهای مهم بهبود سویه و نتایج آن ها را در افزایش تولید اسید استیک خلاصه می کند: